专用氨基酸分析方案用于细胞培养过程监控以及确定蛋白质结构

Paula Hong, Thomas E. Wheat, Eric S. Grumbach, Jo-Ann M. Jablonski, 以及 Jeffrey R. Mazzeo
米尔福德，沃特世公司, MA 01757

简介
沃特世近期推出的AccQ•Tag™ Ultra氨基酸专用分析方案有更高的分离度和灵敏度，确保用户得到精确可靠的氨基酸定性和定量分析结果。这个方案来源于已经被广泛使用和认可的AccQ•Tag柱前衍生方法，得到的衍生物用沃特世ACQUITY UPLC®（超高效液相色谱）系统进行分离，可达到最佳分离度和更高的灵敏度，分析时间更短。系统控制，数据采集、处理和报告由Empower™软件进行。这是一个整体解决方案，针对不同应用的仪器方法和数据处理方法都已经在应用光盘内预先设定好，直接调用即可获得进行分析。

UPLC氨基酸分析应用方案

设计重点与成功分析的关键
• 所有氨基酸都达到基线分离
• 对每个峰进行准确定性
• 衍生反应副产物同氨基酸衍生物可以完全分离
• 3个数量级的动态线性范围，保证对不同浓度水平的氨基酸准确定量
• 足够的电喷雾离子化灵敏度与稳定性

衍生反应过程示意图

使用AccQ•Tag Ultra衍生试剂（6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯）对氨基酸进行衍生，伯氨基酸和仲氨基酸均可快速、定量完成衍生反应，操作简便，衍生反应还可以自动化进行（batch wise）。
• 衍生反应在大量水溶液存在的条件下进行，对不同缓冲液体系和不同组成的样品均可得到可靠的结果
• 样品无需进行特殊处理，也不需要真空干燥或提取
• 样品经衍生后的产物可稳定保存几天
• 过量的衍生试剂可在一分钟内水解为不干扰测定的AMQ，因此不需要去除过量衍生试剂的操作
• 衍生反应副产物同氨基酸衍生物可以通过色谱达到完全分离

为监测细胞培养过程中发酵液的成分，或者对发酵用培养基进行质量控制，需要分离其它种类的氨基酸。与标准分析方法相比，分析细胞培养液中的氨基酸在分析方法的参数设置上有些不同：AccQ•Tag Ultra洗脱剂A（浓缩液）的稀释倍数不同，还需要较高的柱温。其它参数相同。

蛋白结构鉴定氨基酸组成分析

本方法可用于在蛋白质结构分析中确定蛋白质的氨基酸组成，直接使用标准方法即可得到分析结果。

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蛋白浓度检测

最终的分析结果可以任何常见单位表示，包括每种氨基酸的重量，每次进样的氨基酸总重量和所进样的蛋白质重量是相等的，通过已知的稀释比例即可计算出水解反应的蛋白质质量和样品中蛋白质的浓度。

细胞培养过程监控

AccQ●Tag Ultra氨基酸分析方案可用于检测细胞培养过程中氨基酸的浓度变化，这对于优化细胞生长条件至关重要。仅仅需要很少的细胞培养液，且不需要任何样品制备过程即可进行分析。

方法与ESI-MS完全兼容

对于基质复杂的样品，如细胞培养液中的氨基酸分析，通常需要经过样品前处理后才可进行分析。沃特世AccQ●Tag Ultra方法可以直接对细胞培养液或培养基进行分析，且灵敏度很高。小量样品即可得到分析结果，图中每个色谱图代表了25 nL培养液的分析结果，细胞培养液中的其它组分对氨基酸分析没有任何影响。

对氨基酸盐生物进行准确的定量分析有助于监测生物药物生产过程中的细胞代谢情况。表1显示了随着时间推移不同氨基酸在细胞培养过程中的浓度变化情况，可以看出有的氨基酸浓度增加，有的减少，有的维持不变，在第7天补加了Gln（谷氨酰胺），可以非常清楚地看出氨基酸组成变化的情况。

UPLC®氨基酸分析方案可以与不同的检测器匹配，包括紫外、二极管阵列和荧光检测，同时，此方法使用的流动相与ESI MS检测完全兼容。如果您需要在常规分析中进行氨基酸峰的确证或者分析pmol以下浓度水平的氨基酸检测，光学检测器可以完全达到要求。但在以下应用中ESI MS检测是十分有用的：
• 通过分子量对氨基酸进行确证
• 分析方法的确证
• 用于检测样品中未知或未预料到的色谱峰

结论

• UPLC氨基酸分析方案是一套可靠的交钥匙方案， 可用于蛋白质水解产物分析与细胞培养液监控，且都有预先设好的标准方法；
• 可在很短时间内得出精确的分析结果，用于蛋白质结构分析，包括对含硫氨基酸的分析；同时分析结果还可用于确定蛋白质浓度；
• 可监测在生物药物生产过程中，细胞培养液中氨基酸浓度随细胞生长时间的变化；
• 此方案与ESI MS完全兼容。